霍州煤电机关党委开展“举党旗、亮身份、见行动”活动

高亦豹等在江苏白酒大曲中也检测到瑞士乳杆菌。

除此之外，酶催化法即利用GAD将谷氨酸脱去一分子CO2制备GABA过程中，在酶转化体系中添加一定量的PLP可以促进酶液或全细胞的转化旧。采用大肠杆菌JMl09热击转化法后，将转化细胞液涂布至含100g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，在37℃恒温培养箱倒置培养10～12h，挑取单菌落至含100g/mL氨苄青霉素的10mLLB液体培养基中，置于恒温摇床37℃、200r/min培养8～10h后收集菌体，并提取质粒以便验证和进行后续实验。

1.2 实验方法1.2.1 引物设计以质粒pET-24a(+)-gadB为模板，根据无缝克隆同源臂设计原则分别设计正、反向引物：正向弓I物(F1)：57-GGAGTGTCAAGAATGGACCAGAAGCTGTTAACGGA-3'：反向引物(R1)：5'-ITTATTACCAAGCTTTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTC-3。1.1.2 培养基LB液体培养基(g/L)：分别称取氯化钠10g、酵母粉5g、蛋白胨10g，溶于1L去离子水中，并通过添加2mol/LNaOH或HCl调节pH至7.0。PCR程序：94℃预变性5min，98℃变性10S，55℃退火5S。关于在枯草芽孢杆菌为宿主生产GAD发酵过程中，添加价格低廉的辅酶前体以提高GAD酶活力的研究未见报道。电转培养基：LB液体培养基中分别添加0.5mol/L山梨醇和甘露醇，质量浓度为100g/L的葡萄糖。

由于大肠杆菌自身具备吡哆醛激酶(PdxK)基因和磷酸吡哆醇氧化酶(PdxH)基因，从而形成PLP补救途径(见图1)。化学合成法生产GABA安全性较差、有化学残留，也不易达到医药及食品行业的标准：微生物发酵法得到的GABA是一个多相复杂体系，浓度低，下游产物分离成本高，是生产高纯度、高浓度GABA的一个瓶颈问题。豆豉FS：广东阳江豆豉有限公司。

豆豉F：重庆市永川豆豉食品有限公司。1.2.2 菌株的鉴定1.2.2.1 形态学特征选取初筛获取的纤维素酶活性最高菌株，37℃培养于LB固体培养基24h，记录其菌落形态特征，并进行革兰氏染色观察其菌体细胞形态。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）固体培养基：CMC-Na1.0g，蛋白胨1.0g，酵母粉0.1g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.04g，氯化钠1.0g，琼脂粉1.6g，蒸馏水溶解至200mL，pH调至pH7.0～pH7.2，121℃灭菌15min。H1650台式高速离心机：湘仪集团。

此外，纤维素酶及纤维素酶活性微生物对加工食品的品质及活性成分的提取具有重要的改善作用。SP-752（PC）紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

近年来工农及医药业得到了飞速发展，但同时也产生了大量的产业废弃物，随着全球环境污染问题的愈发严重，这些废弃物的合理利用已成为当前解决环境问题的焦点，如富含纤维类物质的果蔬加工副产物、中药加工残渣及农作物秸秆等的再利用，利用纤维素酶处理已成为重要的解决途径之一。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系相关链接：纤维素酶，3，5-二硝基水杨酸，酒石酸钾钠，羧甲基纤维素钠。纤维素酶的来源广泛，如网翅目、直翅目、鞘翅目等昆虫体内的消化液，以及微生物的代谢产物等，其中以微生物来源纤维素酶报道最多。正向扩增引物UP-1：GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，反向扩增引物UP-2r：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT。

固体培养基加入1.8%～2.0%琼脂粉。柠檬酸：天津市光复科技发展有限公司。本文拟从自然环境及发酵食品中分离筛选高活性纤维素酶产生菌株并优化其产酶条件，旨在丰富纤维素酶活性微生物菌种资源库，并为发酵食品生产、富含纤维素类废弃物的合理利用提供菌种资源，同时也为工业用菌种的开发及其理论研究提供数据支持。3，5-二硝基水杨酸：天津市致远化学试剂有限公司。

亚硫酸钠：天津市光复精细化工研究所。1.2.2.3 gyrB基因序列分析由华大基因合成gyrB基因的PCR扩增引物（UP-1和UP-2r）及测序引物（UP-1S和UP-2Sr）。

PCR反应体系（50L）：2TaqPCRMasterMix25L，正向引物（10mol/L）2L，反向引物（10mol/L）2L，DNA模板1L，ddH2O20L。菌株的16SrDNA基因序列经BLAST比对分析，确定与其亲缘关系最近的属，并基于16SrDNA基因序列利用MEGA5.1软件构建菌株与该属内模式菌株的系统发育树，进而确定该菌株的种属。

羧甲基纤维素钠：天津市天力化学试剂有限公司。纳豆W：北海道はまなす食品株式会社。DY04-13-43-00（LS-30）压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。PCR扩增产物送到华大基因（北京）进行测序。土壤、发酵豆制品（纳豆、豆豉）被用作筛选纤维素酶活性菌株的样品来源。共采集5个土壤样品，命名为1、2、3、4、5，来源于黑龙江中医药大学校园内花草及树木周围土壤。

苯酚：天津市致远化学试剂有限公司。PCR反应体系及扩增条件参照文献。

可产纤维素酶的微生物主要来源于动物及昆虫的消化道，土壤及泉水、湖水的沉积物，青贮饲料，酒醅和窖泥，以及豆豉、黄豆酱、发酵茶等传统发酵食品，这些微生物主要包括细菌、放线菌、酵母菌以及霉菌，其中不可培养的微生物也可能是纤维素酶的重要来源，故研究人员利用宏基因组技术从环境中筛选纤维素酶基因，并在可体外培养的大肠杆菌中表达以获取性能优良的纤维素酶，为纤维素酶的资源挖掘开辟了新途径。1.1.2 培养基LB培养基：胰蛋白胨1.0g，酵母粉0.5g，氯化钠1.0g，蒸馏水溶解至100mL，自然pH，121℃灭菌15min。

纳豆R：株式会社ヤマダイフ一ズプロセシング小樽工場。BSD-100培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2.2.2 16SrDNA基因序列分析提取菌株基因组DNA，并以其为模板进行16SrDNA基因序列扩增，扩增引物及条件参照文献。酒石酸钾钠：天津市鑫铂特化工有限公司。PCR反应体系（50L）：2TaqPCRMasterMix25L，正向引物（10mol/L）1L，反向引物（10mol/L）1L，DNA模板2L，ddH2O21L。正向引物27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物1541R：5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3。

1.2.4 纤维素酶活性优化的正交试验设计根据单因素试验结果，针对每个因素分别选取3个水平，以纤维素酶活力为评价指标，进行L9（34）正交试验，从而确定菌株发酵产纤维素酶的最佳发酵条件，试验因素与水平如表1所示。其他试剂均为国产分析纯。

正向测序引物UP1S：GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA，反向测序引物UP-2Sr：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC。1.1.4 主要设备SW-CJ-2D双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司。

94℃1min，58℃1min，72℃2min，30个循环。细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302-02）：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.3 培养条件对菌株纤维素酶活力的影响依次考察不同发酵条件对菌株产纤维素酶活力的影响，包括培养时间（12h、24h、36h、48h、60h、72h）、培养温度（33℃、35℃、37℃、39℃、41℃）、培养基初始pH（pH3.0、pH5.0、pH7.0、pH9.0、pH11.0）和接种量（2%、4%、6%、8%、10%）共4项指标。PCR扩增条件：95℃变性5min。声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。PB-10酸度计：赛多利斯科学仪器有限公司。

98℃10s，62℃1min，72℃2min，30个循环。XMTD-204数显式电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械有限公司。

PCR扩增条件：95℃变性4min。1.1.3 主要试剂刚果红：北京博奥拓达科技有限公司。

1.2 方法1.2.1 产纤维素酶菌株的分离及筛选称取5.0g采集样品，无菌条件下分别接种至50mLLB液体培养基，37℃恒温培养24h，10倍梯度稀释发酵液，取适当浓度稀释液涂布于LB固体培养基，37℃培养24h，挑取在形态学上存在差异的单菌落，进一步划线于LB固体培养基中培养，如此重复直至纯化。ME203E电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司。